本質上是填料(固定相)的不同,正相色譜柱填料極性強,洗脫順序由弱到強；反相色譜柱填料極性弱，洗脫順序由強到弱。以下是詳細說明：

1、正相色譜

    正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。

    由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。

2、反向色譜

    反向色譜用的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。

常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。